在計算分辨率的理論J限的時候需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì)。我們來看一下使用阿貝衍射J限以及使用瑞利判據(jù)進行的分辨率計算。

先應(yīng)當要牢記：

NA= n x sin α

式中n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的Z大孔徑角大約為144o。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52，則物鏡的Z大NA為1.45。如果使用‘干式’（無浸沒）物鏡，則物鏡Z大NA為0.95（因為空氣的折射率為1.0）。

橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：

d= λ/2 NA

式中λ 是標本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）J限將達到177 nm。

軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：

d= 2 λ/NA2

同樣的，如果我們假設(shè)通過波長514 nm的光來觀察標本且物鏡NA數(shù)值為1.45，則軸向分辨率為488 nm。

在阿貝衍射J限的基礎(chǔ)上，瑞利判據(jù)稍稍得到了細化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ為標本成像用的光波長。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA?！?.22’是一個常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出。這些主要用于對系統(tǒng)當中的問題，例如波的傳遞，進行計算。

將聚光鏡的NA考慮在內(nèi)，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144o，則NAcond數(shù)值將等于0.95。

如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45，聚光鏡的NA為0.95，則分辨率的（理論）J限將達到261 nm。

如上所述，用于對標本成像的光波長越短，可以分辨的細節(jié)越多。因此如果使用400 nm的Z短可見光波長，油浸物鏡NA為1.45，聚光鏡NA為0.95，則R等于203 nm。

要在顯微鏡系統(tǒng)當中達到（理論）分辨率的Z大值，每個光學組件都應(yīng)當具備Z高可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外，觀察標本所用的光波長越短則分辨率越高。Z后，整個顯微鏡系統(tǒng)都應(yīng)當準直對齊。